區別1：外觀區別

正置顯微鏡的物鏡在載物臺上方，透射光源在下方；而倒置顯微鏡物鏡在載物臺下方，透射光源在上方，從外觀上可以很容易區分兩者。

區別2：物鏡光學校正不同

正置顯微鏡的物鏡是為很薄的蓋玻片校準的，鏡身相關標記是0.17之類很低的數值；倒置顯微鏡是為較厚的載玻片、培養皿底部校正的，鏡身相關標記會是1以上的數值。兩者物鏡因此無法通用，可以據此區分正置顯微鏡和倒置顯微鏡。

區別3：物鏡工作距離不同

倒置顯微鏡通常用于觀察溶液中的被檢物，如培養液中的細胞，為了對焦溶液中的懸浮物，倒置顯微鏡的物鏡工作距離會比正置的大。

區別4：放大倍率差異

正置顯微鏡可以選擇100X物鏡，搭配10X目鏡實現1000X高放大倍率；倒置顯微鏡的物鏡放大倍率只有60X，這是因為在100X時物鏡幾乎是貼著樣品的，這個工作距離已經小于容器底部厚度，也就是說在對焦成功前物鏡就已經 撞上容器底部了，根本不可能對焦。

區別5：倒置標配相襯觀察

倒置顯微鏡常用于無色透明的活細胞觀察，因此標配相襯環和相襯物鏡以實現相襯觀察，通常會有4X、10X、20X和40X四種放大倍率，還會有相襯物鏡。正置顯微鏡要做相襯觀察的話需要特殊的聚光鏡配件，因此相襯的正置顯微鏡并不常見，而且標配物鏡不包含相襯物鏡。

區別6：樣品高度限制小

倒置顯微鏡的聚光鏡采用長工作距離設計，部分還可以額外加高，以適應更高的樣品，比如MI52-CF加高了聚光燈，可放下10層細胞工廠。

另外部分倒置顯微鏡還可能取消上光源，以解除樣品高度限制，比如MJ42金相顯微鏡，采用倒置的反射照明，沒有上光源，可以很方便地直接放置觀察大尺寸的金屬材料樣品，減少制樣的麻煩。